Práctica de microscopio (página 2)

Partes: 1, 2

MARCO
TEÓRICO:

El microscopio es un instrumento óptico que
amplifica la imagen de un
objeto pequeño. Es el instrumento que más se usa en
los laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante un
sistema de lentes
y fuentes de
iluminación se puede hacer visible un
objeto microscópico. Los microscopios pueden aumentar de
100 a cientos de miles de veces el tamaño
original

PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO
COMPUESTO

Sistema óptico
- OCULAR: Lente situada cerca del ojo del
  observador. Amplía la imagen del objetivo.
- OBJETIVO: Lente situada cerca de la
  preparación. Amplía la imagen de
  ésta.
- CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos
  luminosos sobre la preparación.
- DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que
  entra en el condensador.
- FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el
  condensador.
Sistema mecánico
- SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o
  base y el brazo.
- PLATINA: Lugar donde se deposita la
  preparación.
- CABEZAL: Contiene los sistemas
  de lentes oculares. Puede ser monocular,
  binocular..
- REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes
  objetivos. Permite, al girar, cambiar los
  objetivos.
- TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que
  aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el
  enfoque correcto.

TIPOS DE
MICROSCOPIOS:

MICROSCOPIO OPTICO

por lo que la resolución de un objeto es función de
la apertura numérica; cuanto mayor Los microscopios de
este tipo generalmente producen un aumento de 1000 veces el
tamaño original. El límite lo tienen en unas 2000
veces.

Las lentes de un microscopio óptico son el
condensador, el objetivo y el ocular. La luz que entra en el
sistema debe enfocarse sobre la preparación y para esto se
utiliza el condensador. Elevando o bajando el condensador puede
alterarse el plano del foco de luz y elegirse una posición
que consiga el foco preciso. El objetivo es la lente situada
cerca del objeto que se observa. El aumento primario del objeto
es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al
ocular, donde se realiza el aumento final.
Los microscopios que se usan normalmente en microbiología están equipados con
tres objetivos: bajo poder, alto
poder y objetivo de inmersión. Estos objetivos
están montados sobre una pieza que se llama revolver que
puede rotarse para alinear el objetivo deseado con el
condensador.

La imagen formada por el objetivo es finalmente
aumentada por el ocular. El aumento total de un microscopio
compuesto es el producto del
aumento de su objetivo y de su ocular. El microscopio compuesto
es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el
microscopio construido con una sola lente. Este último,
llamado microscopio simple, se usa principalmente como lupas y
cristales de aumento.

Además del aumento, una propiedad
importante de un microscopio es su poder resolutivo; esto es la
capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy
cercanos. Cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor será
la definición de un objeto. Los microscopios de gran poder
resolutivo son especialmente buenos para ver pequeñas
estructuras.
El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la
longitud de onda utilizada y de una propiedad óptica de la
lente conocida como apertura numérica. Como los
microscopios ópticos utilizan luz visible, la longitud de
onda está fijada y es sea la apertura, el objeto resuelto
será más pequeño.

0.5 l

d = ———–

N sen a

d: poder resolutivo; l: longitud de onda; a: mitad del
ángulo de la lente objetivo; N: índice de
refracción del medio; N sen a: apertura
numérica.

Un factor que afecta a la apertura numérica, además
de la construcción de la lente, es el medio a
través del cual pasa la luz. Mientras que el objetivo
esté separado del objeto por el aire, su apertura
numérica nunca será mayor de 1,0; para conseguir
aperturas numéricas mayores que ésta, el objetivo
debe estar inmerso en un líquido de mayor índice de
refracción que el aire. A estos líquidos se les
denomina aceites de inmersión que se utilizan con los
objetivos de inmersión obteniendo una apertura
numérica entre 1,2 y 1,4. Aún así, al
utilizarse la luz visible (longitud de onda) estos microscopios
llegan a tener un poder de resolución de aproximadamente
0,25 µm, lo que significa que las partículas con un
tamaño más pequeño de 0,25 µm no
pueden distinguirse unas de otras.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

Los microscopios electrónicos utilizan rayos de
electrones en lugar de la luz, lo que les permite tener un poder
de resolución muy elevado. La longitud de onda de los
rayos de electrones es de 0,005 – 0,0003 nm, muy corta comparada
con la de la luz visible (426 – 750 nm; violeta – rojo). Es
posible con el microscopio electrónico resolver objetos
separados por una distancia de 0,003 µm, comparado con los
0,25 µm de uno óptico. Los aumentos pueden llegar a
ser de un millón de veces.

A causa de la naturaleza de
este instrumento sólo pueden examinarse objetos muy
delgados; incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser
observada directamente. Por lo que, para preparar muestras para
el microscopio electrónico se necesitan técnicas
especiales de cortes ultra finos. Para seccionar las células
primero deben ser fijadas y deshidratadas (etanol o acetona).
Después de la deshidratación, la muestra se
incluye en una resina y es aquí donde se realizan cortes
finos con un ultra micrótomo, por lo general equipado con
una cuchilla de diamante. Una sola célula
bacteriana puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas. Si
sólo tiene que observarse el contorno de un organismo, no
son necesarias secciones finas por lo que se montan
células enteras que se recubren de una capa fina de un
metal pesado (oro). El rayo
de electrones es dirigido sobre la preparación y los
electrones dispersados por el metal pesado activan una pantalla
de observación produciendo una imagen. A la
primera técnica se la denomina Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) y a
la segunda Microscopía Electrónica de Barrido
(MEB).

MANEJO Y USO DEL
MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

Colocar el objetivo de menor aumento en
posición de empleo y
bajar la platina completamente. Si el microscopio se
recogió correctamente en el uso anterior, ya
debería estar en esas condiciones.
Colocar la preparación sobre la platina
sujetándola con las pinzas metálicas.
Comenzar la observación con el objetivo de 4x
(ya está en posición) o colocar el de 10
aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.
2. Acercar al máximo la lente del objetivo a
  la preparación, empleando el tornillo
  macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente
  y no a través del ocular, ya que se corre el
  riesgo
  de incrustar el objetivo en la preparación
  pudiéndose dañar alguno de ellos o
  ambos.
3. Mirando, ahora sí, a través de los
  oculares, ir separando lentamente el objetivo de la
  preparación con el macrométrico y, cuando se
  observe algo nítida la muestra, girar el
  micrométrico hasta obtener un enfoque
  fino.
Para realizar el enfoque:
Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería
estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un
poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si
al cambiar de objetivo se perdió por completo la
imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo
anterior y repetir la operación desde el paso 3. El
objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la
preparación y por ello es fácil que ocurran dos
tipos de percances: incrustarlo en la preparación si
se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con
aceite de
inmersión si se observa una preparación que ya
se enfocó con el objetivo de inmersión.
2. Bajar totalmente la platina.
3. Subir totalmente el condensador para ver
  claramente el círculo de luz que nos indica la zona
  que se va a visualizar y donde habrá que echar el
  aceite.
4. Girar el revólver hacia el objetivo de
  inmersión dejándolo a medio camino entre
  éste y el de x40.
5. Colocar una gota mínima de aceite de
  inmersión sobre el círculo de
  luz.
6. Terminar de girar suavemente el revólver
  hasta la posición del objetivo de
  inmersión.
7. Mirando directamente al objetivo, subir la
  platina lentamente hasta que la lente toca la gota de
  aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y
  se adosara a la lente.
8. Enfocar cuidadosamente con el
  micrométrico. La distancia de trabajo
  entre el objetivo de inmersión y la
  preparación es mínima, aun menor que con el
  de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy
  grande.
9. Una vez se haya puesto aceite de inmersión
  sobre la preparación, ya no se puede volver a usar
  el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de
  aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que
  bajar la platina y repetir la operación desde el
  paso 3.
10. Una vez finalizada la observación de la
  preparación se baja la platina y se coloca el
  objetivo de menor aumento girando el revólver. En
  este momento ya se puede retirar la preparación de
  la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de
  inmersión en posición de
  observación.
11. Limpiar el objetivo de inmersión con
  cuidado empleando un papel especial para óptica.
  Comprobar también que el objetivo 40x está
  perfectamente limpio.
Empleo del objetivo de
inmersión:

MANTENIMIENTO Y
PRECAUCIONES

Al finalizar el trabajo,
hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en
posición de observación, asegurarse de que la
parte mecánica de la platina no sobresale del
borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.
Cuando no se está utilizando el microscopio,
hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se
ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma
prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario
para protegerlo del polvo.
Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se
ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o,
mejor, con un papel de óptica.
No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si
no se está utilizando el microscopio.
Después de utilizar el objetivo de
inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el
objetivo con pañuelos especiales para óptica o
con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se
pasará el papel por la lente en un solo sentido y con
suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el
objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar
de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos
disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su
sujeción.
No forzar nunca los tornillos giratorios del
microscopio (macrométrico, micrométrico, platina,
revólver y condensador).
El cambio de
objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo
siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce
de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo
agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se
está observando a través del ocular.
Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si
se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con
un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un
paño humedecido en xilol.
Es conveniente limpiar y revisar siempre los
microscopios al finalizar la sesión práctica y,
al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y
revisión general de los mismos.

Los procedimientos realizados con la
manipulación del microscopio óptico compuesto
viendo sus partes, su morfología, sus uso e
importancia.
PROCEDIMIENTOS:
La ciencia
que investiga los objetos pequeños utilizando este
instrumento se llama microscopía.
Sin este aparato seria imposible visualizar los
microorganismos a simple vista es fundamental en el avance de
la citología, citogenética,
microbiología, fitopatología virología,
bacteriología, parasitología y demás
ciencias
que se trabaja con microorganismos.
CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFÍA: